本課題組在《Theranostics》上發(fā)表了一篇題為“Evaluation of the tumor-targeting efficiency and intratumor heterogeneity of anticancer drugs using quantitative mass spectrometry imaging”的研究論文，采用空氣動力輔助解吸電噴霧離子化（AFADESI）技術(shù)和基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）的虛擬校正-定量質(zhì)譜成像（VC-QMSI）方法，建立了針對紫杉醇及其衍生物前藥的體內(nèi)定量成像方法，為評估該類藥物的腫瘤靶向效率和瘤內(nèi)異質(zhì)性分布提供了直觀有效的途徑，也為靶向抗腫瘤新藥研發(fā)提供了有力的研究工具。

    可區(qū)分正常組織和腫瘤組織的靶向抗腫瘤藥物開發(fā)是癌癥治療研究中的關(guān)鍵問題。在新藥研發(fā)的早期，如何快速評估抗癌藥物的腫瘤靶向性非常重要，且了解藥物在腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性分布更具挑戰(zhàn)。開發(fā)一種高精度、高靈敏度的定量成像分析方法有望解決這一難題。質(zhì)譜成像是一種無需標(biāo)記的分子成像技術(shù)，它可提供有關(guān)生物體內(nèi)藥物和代謝物分布的時空信息，其在藥物開發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用正在迅速增加。紫杉醇具有很強的抗腫瘤活性，但直接用藥常伴隨有骨髓抑制、神經(jīng)毒性等嚴(yán)重不良反應(yīng)；近年來臨床致力于對紫杉醇進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化、劑型改造或前體藥物開發(fā)，以提高藥物的腫瘤靶向能力，減少副作用。本研究建立了紫杉醇及其衍生物前藥的體內(nèi)定量成像方法，評估了該類藥物的腫瘤靶向效率和瘤內(nèi)異質(zhì)性分布。

   通過構(gòu)建含已知濃度藥物的模擬生物組織，建立了定量質(zhì)譜成像標(biāo)準(zhǔn)曲線；采用空氣動力輔助解吸電噴霧離子化質(zhì)譜成像（AFADESI-MSI）技術(shù)，同時采集藥物、藥物代謝物和內(nèi)源性代謝物信息；以內(nèi)源性代謝物為內(nèi)標(biāo)，結(jié)合ANN方法，構(gòu)建了生物組織中質(zhì)譜響應(yīng)基體效應(yīng)自動預(yù)測與校正的回歸模型，對動物切片的單位像素進行逐一定量，從而建立了整體動物體內(nèi)藥物質(zhì)譜成像分析方法。將該方法用于評估靜脈注射紫杉醇（PTX）、紫杉醇脂質(zhì)體（PTX-liposome）和紫杉醇前藥（PTX-R）在A549細胞異種移植裸鼠中的靶向效率和瘤內(nèi)的分布異質(zhì)性。

圖1 VC-QMSI策略在整體動物組織中準(zhǔn)確定位抗腫瘤藥物的過程示意圖 （A）基于內(nèi)源性代謝物的機器學(xué)習(xí)方法預(yù)測相對校正因子的示意圖 （B）不同器官的相對校正因子成像以及相對校正因子預(yù)測值和實測值的比較；縮寫：H心臟，Li肝臟，Sp脾，Lu肺，K腎，Br大腦，M肌肉，Tu腫瘤 （C）以藥物含量-未校正的藥物響應(yīng)強度構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線和以藥物含量-校正后的藥物響應(yīng)強度構(gòu)成的虛擬校正標(biāo)準(zhǔn)曲線對比 （D）通過使用K均值和t-SNE聚類分析進行自動像素標(biāo)記的整體動物分割圖像 （E）整體動物體內(nèi)藥物定量的可視化結(jié)果以及光學(xué)圖像

2 噴霧溶劑選擇

    考察了多種有機溶劑/水組合以及揮發(fā)性鹽對藥物響應(yīng)值的影響，終優(yōu)選出乙腈：水（5:5）作為更佳噴霧溶劑。它能對藥物及內(nèi)源性代謝物進行有效的解吸、提取以及離子化，達到靈敏準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

圖2 三個給藥組在不同時間點的AFADESI-MSI可視圖（A）PTX在整體動物體內(nèi)的時空和定量分布（B）PTX在腫瘤組織中的時空和定量分布

4 PTX-R的瘤內(nèi)異質(zhì)分布

    腫瘤根據(jù)形態(tài)學(xué)的異質(zhì)性可分為不同的微區(qū)（圖3A，3B）。基于代謝物特征采用t-SNE和k-means等手段得到的腫瘤微區(qū)自動識別的結(jié)果（圖3C）與H＆E染色結(jié)果（圖3A）高度一致。PTX-R在腫瘤壞死區(qū)域和膠原蛋白區(qū)域的含量明顯高于腫瘤薄壁組織區(qū)域（圖3D，3E, 3F），表明PTX-R具有出色的腫瘤穿透能力。對比腫瘤的薄壁組織和間質(zhì)區(qū)域，PTX-R更多地積累于腫瘤中未明顯分化的區(qū)域，比如腫瘤的膠原蛋白區(qū)域和脂肪組織。這種藥物在腫瘤微區(qū)分布的異質(zhì)性值得進一步研究，它對于認識腫瘤的生長、侵襲、對藥物的敏感性以及預(yù)后均有重要作用。

圖3 PTX-R在瘤內(nèi)的異質(zhì)分布（A）腫瘤組織的H＆E染色圖像（B）放大倍數(shù)（×20）的代表性腫瘤微區(qū)（C）基于代謝物譜的腫瘤微區(qū)的t-SNE空間分布（D）PTX-R在腫瘤微區(qū)中的分布（E）藥物離子成像和H＆E染色成像之間的耦合匹配疊加圖（F）腫瘤微區(qū)中PTX-R的定量分布

    采用無需標(biāo)記的AFADESI和VC-QMSI技術(shù)成功建立了針對紫杉醇及其前藥的定量質(zhì)譜成像方法，評估了該類抗腫瘤藥物的腫瘤靶向效率和瘤內(nèi)分布異質(zhì)性，并提供了直觀的實驗證據(jù)表明設(shè)計的紫杉醇前藥具備優(yōu)異的腫瘤蓄積能力和低全身毒性。進一步證明AFADESI-MSI技術(shù)具有高靈敏和寬覆蓋的特點，可在整體動物的體內(nèi)微區(qū)同時可視化各種類型的藥物、代謝物和內(nèi)源性代謝物。VC-QMSI方法將內(nèi)源性代謝物作為內(nèi)標(biāo)，建立ANN模型；根據(jù)模型預(yù)測每個像素的RCF值，并校正藥物離子強度，從而實現(xiàn)藥物在整體動物和亞器官組織中的定量可視化。紫杉醇前藥及其代謝物的體內(nèi)定量分布研究有助于從藥物的保留、消除、靶向和釋放四個角度設(shè)計有效的腫瘤靶向藥物。所建方法有助于預(yù)測與藥物分布相關(guān)的藥效和安全性，在抗腫瘤藥物研發(fā)早期進行直接快速的藥效篩查，減少損耗、降低成本。此外，本研究對闡明藥物的功效、毒性和耐藥性提供了一個深入的視角，有助于抗腫瘤藥物的設(shè)計和優(yōu)化。

Jin Zhang, et al. (2020). “Evaluation of the tumor-targeting efficiency and intratumor heterogeneity of anticancer drugs using quantitative mass spectrometry imaging.” Theranostics 10(6): 2621-2630.